Химические свойства аминокислот

Среди многих превращений, которые претерпевают аминокислоты, нас в первую оче-редь интересуют те, которые используются для синтеза из них пептидов. Эти вещества наряду с регуляторными белками играют важную роль в функционировании многокле-точных организмов в качестве гормонов, нейромедиаторов и других средств межкле-точной коммуникации. Так, например, пептидами являются все гормоны гипоталамуса и гипофиза, инсулин и многие другие. Нейромедиаторные пептиды представлены энке-фалинами, эндорфинами, динорфинами у млекопитающих, а у насекомых нейромедиа-тором возбуждения является петапептид проктолин – Арг-Тир-Лей-Про-Тре.

Аминокислоты, содержащие карбоксильную группу и аминогруппу, могут диссоцииро-вать как кислоты и как основания. В кислой среде аминокислота мигрирует к катоду, а в щелочной среде – к аноду. Для каждой аминокислоты существует свое значение рН, при котором кислотная и основная диссоциация одинаковы. Это значение называется изоэлектрической точкой. Солевой характер аминокислот определяет отсутствие у них летучести и плохую растворимость в абсолютном спирте и в органических раствори-телях. Если аминогруппа протонирована, то карбоксильная группа аминокислоты дис-социирует легче, чем карбоксильная группа уксусной кислоты. В свою очередь, амино-группы аминокислот менее основны, чем аминогруппа метиламина. Еще ниже основ-ность у эфиров аминокислот, так этиловый эфир глицина имеет значение рК 7,7 (его раствор имеет почти нейтральную реакцию), тогда как у метиламина, например, оно равно 10,6.

Для получения из двух аминокислот дипептида определенного строения надо в моле-куле одной аминокислоты защитить аминогруппу (получить «карбоксильную компо-ненту»), а в другой защитить карбоксильную группу (получить «аминную компонен-ту»), причем защитные группы должны сниматься в условиях, которые обеспечивают сохранение образовавшейся пептидной связи.

Проще всего обстоит дело с защитой карбоксильных групп для получения аминной компоненты. Обычно карбоксильные группы этерифицируют при нагревании протони-рованных по аминной группе аминокислот в спирте, насыщенном хлористым водо-родом. В качестве спиртов используют метанол или этанол, поскольку такие эфиры омыляются эквивалентным количеством разбавленной щелочи (чаще всего это гидр-оксид лития), тогда как пептидные связи сравнительно устойчивы к действию щелочей. Однако наиболее предпочтительно использование бензиловых эфиров, которые отщеп-ляются гидрогенолизом в нейтральной среде. Их можно получать как этерификацией в присутствии, например, п-толуолсульфокислоты или кислых ионобменных смол, так и взаимодействием цезиевых солей аминокислот с бензилбромидом:

При гидрировании на палладиевом катализаторе бензиловые эфиры отщепляют бен-зильную группу с образованием толуола.

Еще один способ защиты карбоксильной группы представлен образованием трет.-бу-тилового эфира. В отличие от метиловых и этиловых эфиров эта защитная группа устойчива к действию щелочей, но она в мягких условиях снимается действием три-фторуксусной кислоты в метиленхлориде или бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте.

трет-Бутиловые эфиры аминокислот могут быть также получены по реакции пере-этерификации из трет-бутилацетат и соли аминокислоты.

Очень легко образуются эфиры карбоновых кислот при действии на них спирта и тио-нилхлорида. При добавлении тионилхлорида к суспензии или к раствору аминокис-лоты в метаноле сначала образуется реакционноспособный моноэфир хлорангидрида сернистой кислоты, который реагирует с карбоксильной группой с образованием не-стойкого смешанного ангидрида, разлагающегося с элиминированием диоксида серы.

Таким образом, например, можно этерифицировать более слабую - или соответ-ственно-карбоксильную группу глютаминовой или аспарагиновой кислоты, добавляя один эквивалент тионилхлорида к суспензии соли кислоты в метаноле.

Одна из современных защитных групп – это триметилсилилэтильная. Такие эфиры образуются при конденсации солей аминокислот с гидроксиэтилтриметилсиланом в присутствии специального реагента для активации карбоксильных групп в аминокисло-тах – дициклогексилкарбодиимида. Для снятия этой защитной группы используется вы-сокое сродство кремния к фтору. В присутствии фторидных ионов такие эфиры распа-даются на анион кислоты, этилен и триметилфторсилан, гидролизующийся с образо-ванием фтористого водорода и триметилсиланола. Все другие не содержащие атомы кремния защитные группы устойчивы к действию фторидов.

Более серьезной проблемой является получение аминокислоты с защищенной амино-группой. Для этого чаще всего используется ацилирование, но оно приводит к амидным связям, которые по своей природе мало отличаются от пептидных (появляются пробле-мы со снятием таких защитных групп). Кроме того, для получения пептидной связи нужна активация карбоксильной группы, поскольку сами карбоксильные группы всту-пают в реакции ацилирования лишь в очень жестких условиях. Но при этом оказалось, что перевод N-ацилзамещенных аминокислот, например, в хлорангидриды приводит к практически полной рацемизации карбоксильной компоненты. Долгое время с этим приходилось мириться, и лишь в начале тридцатых годов прошлого столетия был най-ден карбаматный способ защиты аминогруппы, который широко используется до сих пор. Сначала в качестве реагента использовался бензилхлорформиат(карбонат):

Такая защитная группа называется карбобензокси- (Cbz). После синтеза пептида карбо-бензоксигруппа снимается гидрогенолизом. Это очень удобный способ, но его нельзя применять для получения пептидов с участием метионина и цистеина, так как соеди-нения серы отравляют палладиевый катализатор. Правда, эту защитную группу можно снять и действием раствора бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте.

В настоящее время широкое распространение получила защита с помощью трет.-бут-оксикарбонильной группы (ВОС-защита), которая легко снимается кислотами (три-фторуксусной кислотой) в мягких условиях, в которых пептидные связи не затрагива-ются. Для введения ВОС-защиты раньше использовали трет.-бутилхлорформиат, обра-зующийся из трет.-бутанола и фосгена, но это вещество при хранении разлагается на изобутилен, хлористый водород и диоксид углерода (это все газы, возможны хлопки сосудов с этим реагентом).

Его пытались заменить азидом (СH₃)₃COC(O)N₃, но появились сообщения о взрывах этого вещества. Сейчас используют совершенно безопасный ди-трет.-бутилпирокарбо-нат, образующийся по схеме:

Полученный диэфир пироугольной кислоты, для него используется обозначение (ВОС)₂О, в присутствии оснований ацилирует аминокислоты по атому азота с образо-ванием соответствующих карбамоильных производных, диоксида углерода и трет.-бу-тилового спирта.

Приведенные реакции предназначены для получения аминокислот с защищенными аминогруппами (карбоксильные компоненты) и аминокислот с защищенными карб-оксильными группами (аминные компоненты), которые могут быть использованы для направленного синтеза пептидов определенного строения, в ходе которого должны быть образованы пептидные связи (так называют амидные связи, образованные между карбоксильными и аминными группами белковых аминокислот).

Следующие далее краткие описания стадий пептидного синтеза демонстрируют слож-ность проблемы, а также лабильность незащищенных или защищенных аминокис-лотных структурных единиц. Как уже отмечалось выше, при синтезе пептидов акти-вация карбоксильных групп за счет перевода их в хлорангидриды используется крайне редко, так как хлорангидриды N-ацилированных аминокислот (даже если ацильная группа представлена карбамоильной) рацемизуются уже во время их синтеза.

В основе рацемизации производных аминокислот лежит образование азлактонов по схеме:

Понятно, что кинетика этого процесса определяется не только условиями, в которых проводится пептидный синтез, но и природой групп R,Yи Х. Лучшей группойYявляется алкоксигруппа (карбаматы), а лучшей группой Х – азидная группа. Активация карбоксильной группы за счет образования азида практически не сопровождается рацемизацией. Это можно объяснить тем, что электроотрицательный атом кислорода карбонильного фрагмента защитной группы координирован не на атом углерода ацил-азида, а на положительно заряженный атом азота азидного остатка:

Азиды кислот получают из соответствующих эфиров через их гидразиды действием на последние азотистой кислоты.

Однако азиды кислот очень легко гидролизуются и не хранятся даже в сухом виде, так как они легко теряют азот и претерпевают перегруппировку Курциуса:

Поэтому их переводят в более стабильные и также очень реакционноспособные про-дукты О-ацилирования производных гидроксиламина, например N-гидроксисукцин-имида или 1-гидроксибензтриазола:

Сравнительно устойчивы к рацемизации смешанные ангидриды из N-ацилированных аминокислот и моноэфиров угольных кислот. Их получают взаимодействием производ-ных аминокислот с изобутилхлорформиатом в присутствии таких оснований, как три-этиламин:

Такими смешанными ангидридами можно ацилировать даже аминокислоты с незащи-щенными карбоксильными группами. В реакции ацилирования этими смешанными ан-гидридами уходящей группой является алкоксикарбонильный фрагмент, то есть нук-леофил атакует карбонильный углерод аминокислотной компоненты, так как электро-фильность остатка угольной кислоты сильно снижена электронодонорным эффектом алкоксильной группы (общее правило гласит – уходит остаток более сильной кислоты).

Хорошей ацилирующей способностью отличаются также п-нитрофениловые эфиры аминокислот. Определенный интерес для синтеза пептидов представляет карбонилди-имидазол или мочевина Штааба – продукт реакции имидазола с фосгеном. При дейст-вии этого вещества на смесь двух аминокислот со свободной карбоксилатной и амин-ной группами образуется пептидная связь. Промежуточным продуктом при этом стано-вится ацилированный замещенной по аминогруппе аминокислотой имидазол, который легко подвергается аминолизу аминогруппой другой защищенной по карбоксилатной группе аминокислоты.

Таких способов образования пептидных связей за счет активации карбоксильных групп на сегодняшний день известно более 130. И все же основной способ образования пеп-тидной связи основан на использовании в качестве активаторов карбоксильных групп (конденсирующих агентов) карбодиимидов, главным из которых является дициклогек-силкарбодиимид. Гетерокумуленовая структура карбодиимидов объясняет их очень высокую реакционную способность, которая в значительной мере зависит от замес-тителей у атомов азота. Так, например, диэтилкарбодиимид С₂Н₅-N=C=N-С₂Н₅, легко полимеризуется, а дифенилкарбодиимид легко присоединяет воду и другие Н‑кислоты.

По аналогичной схеме карбодиимиды присоединяют карбоновые кислоты с образова-нием О-ацилзамещенных изомочевин

Эти вещества отличаются высокой реакционной способностью. Так, например, они уже при комнатной температуре изомеризуются в N-ацилмочевины или же ацилируют остающуюся кислоту с образованием ее ангидрида

В пептидном синтезе при температуре ниже 0С на смесь кислотной и аминнной ком-понент действуют дициклогексилкарбодиимидом (DCC,ДЦГК), который до недавнего времени был основным реагентом в синтезе пептидов. Сначала в реакцию вступает карбоксильная группа кислотной компоненты, превращаясь в соответствующую О‑ацилизомочевину, которая реагирует с аминной компонентой с образованием дипеп-тида, защищенного по карбоксильной и по аминной группе, а карбодиимидный фраг-мент превращается в дициклогексилмочевину, которая практически нерастворима в таких растворителях, как дихлорметан, и выпадает в виде легко отделяемого кристал-лического осадка. Сейчас в качестве конденсирующего агента чаще всего используют гидрохлоридN'-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида (EDC), образующаяся из него мочевина легко растворяется в воде.

Общая схема пептидного синтеза может быть представлена уравнением

Здесь Х означает активированное состояние кислоты (образование смешанного ангид-рида, имидазолида или ацилизомочевины), Y иZ означают защитные группы для карб-оксильной и аминной функций, а обозначениеProt у боковых радикалов производных аминокислот означает, что защите подлежат не только аминогруппа и карбоксильная группа в соответсвующих аминокислотах, но и функциональные группы в боковых радикалах, которые также могут вступать в реакции ацилирования. Если теперь дол-жен быть получен трипептид, то следует еще до начала синтеза учесть, что ацилирова-ние пептидом допустимо лишь в тех случаях, когда С-концевая аминокислота представ-лена нерацемизующейся аминокислотой глицином или очень устойчивой к рацеми-зации аминокислотой пролином. Иначе в образовавшемся пептиде предшествующий добавленной аминокислоте фрагмент подвергнется рацемизации, поскольку он пред-ставлен амидом а не карбаматом. Поэтому для синтеза небольших пептидов наращива-ние цепи проводят путем ацилирования концевой аминогруппы аминокислотой, у которой аминогруппа защищена образованием карбамата. С ростом длины цепи все сложнее и сложнее становится отделение продукта реакции от непрореагировавшего пептида из-за того, что добавление одной аминокислотной компоненты все меньше и меньше сказывается на свойствах удлиняющейся молекулы. Поэтому для получения чистых продуктов все же приходится использовать в синтезе пептидные фрагменты, но при этом, как уже отмечалось выше, С-концевая аминокислота в них должна быть представлена пролином или глицином. Если же такая возможность исключена, то С‑концевая аминокислота может быть представлена алифатической монокарбоновой кислотой с одной аминогрупой, особенно если у нее большой алкильный заместитель (валин, лейцин). Ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) и аминокислоты с электроотрицательным заместителем в-положении (серин, треонин, цистеин) в отличие от них более склонны к рацемизации.

В историческом плане можно отметить, что после открытия в 1932 году карбобензокси-защиты основные усилия были направлены на разработку защитных групп не только для -аминогруппы, но и для функциональных групп в боковых цепях аминокислот, а также на поиск конденсирующих агентов. В 1955 году Нобелевской премией были отмечены работы американского биохимика Дю Виньо, синтезировавшего в 1953 году нонапептид с гормональной активностью окситоцин

,

у которого сульфгидрильные группы цистеиновых остатков в положениях 1 и 6 обра-зуют дисульфидный мостик, а С-концевой глицин представлен амидом. По мнению многих специалистов именно с этой работы начинается настоящая химия пептидов. Это достижение впечатляет еще и потому, что основной конденсирующий агент для образо-вания пептидных связей из кислотных и аминных компонент – дициклогексилкарбо-диимид – был введен в практику уже после этих работ. Следующим этапом в химии пептидов стал разработанный Меррифилдом твердофазный синтез (SPPS), отмеченный Нобелевской премией 1984 года. Этот исследователь получил на полимерной подложке достаточно простой тетрапептид Лей-Ала-Гли-Вал (радикалы входящих в его состав аминокислот представлены только алкильными остатками).

В 1969 году появилась серия кратких сообщений в JACSо полном синтезе нескольких миллиграммов ферментов, содержащих около 120 аминокислотных фрагментов. Их биологическая активность составляла от 1 до 13 % от активности натурального фер-мента. Эти сообщения были опубликованы в кратчайшие сроки, поскольку они, очевид-но, соответствовали идее химического сообщества о возможности полного синтеза бел-ковой молекулы, не отличающейся по активности от природного субстрата.

Через семь лет в критическом обзоре, посвященном синтезу пептидов, появилось такое утверждение: «Синтетики в первую очередь должны принимать во внимание класси-ческие критерии, которые характеризуют синтез природного продукта, то есть они должны отдавать себе отчет в том, что синтез натурального продукта был успешным только в том случае, когда физические, химические и биологические свойства синтети-ческого соединения полностью совпадают с такими же свойствами натурального про-тотипа. К несчастью ни один из «синтетических белков» не соответствует этим кри-териям. Часто утверждается, что эти критерии не применимы к более сложным ситуа-циям, но похоже на то, что снижение стандартов чистоты не приближает нас к реше-нию проблемы. Имеющиеся в нашем распоряжении аналитические методы не пригод-ны для адекватного отражения негомогенности в составе высокомолекулярных пеп-тидов, образующихся в результате постадийного синтеза. Из этого следует, что синте-тический способ может быть выбран только для тех случаев, когда продукт может быть очищен, а его свойства критически оценены соответствующими аналитическими прие-мами» (F.M.Finn, 1976).

Теперь же мы переходим от общих проблем пептидного синтеза к специальным проб-лемам, связанным с тремя наиболее важными на сегодняшний день процедурами:

а) пептидный синтез на твердой фазе

б) способы синтеза пептидов в растворах

в) конденсация пептидных фрагментов