Пептидный синтез на твердой фазе

Для иллюстрации специфических операций, входящих в этот процесс, начиная от первых шагов с присоединением карбоксильной концевой аминокислоты до последней реакции отсоединения пептида, приведена общая схема. В качестве твердой основы для синтеза используют смолу, полученную сополимеризацией стирола с добавлением 1-2 % дивинилбензола. Такой полимер набухает в органических растворителях, однако он совершенно нерастворим в них. Фенильные группы в его составе хлорметилируют действием бис-хлорметилового эфира в присутствии хлорида цинка.

В качестве альтернативных основ для твердофазного синтеза можно использовать не набухающие подложки из пористого стекла, на которых реакции и массообменные про-цессы идут с более высокой скоростью, а для присоединения органических замес-тителей к поверхности используют присоединенные к силикатным группам силаноль-ные группы. Для присоединения по хлорметильной группе первой аминокислоты этот полимер обрабатывают избытком защищенной по аминогруппе аминокислоты в присутствии триэтиламина в этилацетате:

Обработка хлористым водородом в уксусной кислоте снимает трет.-бутоксикарбо-нильные (ВОС) группы, отщепляющиеся в виде изобутена и диоксида углерода. Обра-зующийся гидрохлорид амина нейтрализуют триэтиламином в ДМФ. Затем в присутствии ДЦГК свободную аминогруппу ацилируют другой N-ВОС-заме-щенной аминокислотой.

За этим следует цикл: снятие N^-защиты, нейтрализация и новое ацилирование. Все стадии могут быть проведены с очень высоким общим выходом (около 99,5 %), поскольку возможно использование большого избытка (до четырехкратного) ВОС-ами-нокислоты и ДЦГК в метиленхлориде и поскольку побочные реакции, приводящие к растворимым продуктам, не снижают выход продукта конденсации. Одна из побочных реакций с участием ДЦГК приводит кN-ацилированным мочевинам. Эти продукты остаются в растворе и не реагируют с амином, который связан с полимером. По исте-чении времени реакции полимер с привитым пептидным остатком отфильтровывают и промывают. Время, требуемое для 99 %-ного превращения, колеблется в пределах от 5 минут для небольших аминокислот до нескольких часов для аминокислот с объемны-ми заместителями, например для ВОС-Иле в реакции с другими объемными аминокис-лотами на смоле. Новый цикл начинают без каких-либо проблем с выделением про-дукта реакции в чистом виде (R.B.Merrifield, 1969; B.W.Erickson, 1976; M.Bodanszky, 1976), так как он просто привит к поверхности нерастворимого полимера.

Чистота получаемого на конечной операции продукта в значительной степени зависит от выхода на каждом из циклов. Выход должен быть очень высоким даже для получе-ния продукта с умеренной чистотой (K.Luebke, 1975). Если средний выход при образо-вании амида в синтезе ундекапептида (11 аминокислотных фрагментов) равен, напри-мер, 98 %, то продукт будет содержать около 20 % различных примесей, которые веро-ятнее всего будет очень трудно отделить.

Для сокращения времени протекания реакции в качестве конденсирующего агента обычно берут ДЦГК. Однако, для легко рацемизующихся АК даже этот конденсирую-щий агент дает слишком высокую степень рацемизации. Можно было бы использовать ацилирование азидами, но этот способ слишком продолжителен. В некоторых случаях в качестве безопасной альтернативы берут коммерческие 4-нитрофениловые эфиры (M.Bodanszky, 1976). Для ускорения реакции сочетания с 4-нитрофениловыми эфирами используют 1,2,4-триазол в качестве бифункционального катализатора. Тем не менее время полупревращения составляет несколько часов, а для полного превращения требу-ется не менее 24 часов, а в некоторых случаях 4-нитрофениловые эфиры вообще не дают количественного превращения. И все же эти эфиры отличаются еще двумя преимуществами по сравнению со способом с использованием ДЦГК: с ними не требу-ется защита боковых гидроксильных групп и не наблюдаются неприятные побочные реакции, например образование нитрилов в результате дегидратации аспарагина и глутамина.

Сборка от N-конца к С-концу пептидной цепи неблагоприятна для химического синтеза пептида на твердом носителе. Эта стратегия может быть отброшена хотя бы уже по той причине, что повторяющаяся активация карбоксильных концов наращиваемой пептид-ной цепи может привести к гораздо более высокой степени рацемизации. Но есть и другие более практические недостатки, которые также обесценивают такой подход, и активация кислотной компоненты на полимерной основе обычно используется только для одностадийной конденсации фрагментов.

На каждой стадии обычного пептидного синтеза, осуществляемого от С- к N-концу, N‑защитная группа новой присоединяемой аминокислоты должна быть избирательно удалена так, чтобы все другие защитные группы на боковых цепях пептида оставались незатронутыми. Большинство обычных защитных групп для боковых цепей стабильны по отношению к 50 %-ной трифторуксусной кислоте в метиленхлориде, вследствие чего этот реагент чаще всего используют для снятияN^-защит. В этой смеси подверга-ются ацидолизу только трет.-бутиловые эфиры и карбаматы.

Пептидные цепи, которые не вступили в реакцию сочетания с защищенной аминокис-лотой (наверное из-за специфики стерики в смоле?), несут свободные аминогруппы, тогда как прореагировавшие цепи имеют блокированную -аминогруппу. Если смола необратимо прореагировала с большим избытком ацилирующего агента, эти амино-группы всегда будут концевыми, поскольку рост цепи на них ингибирован. Ацети-лирование уксусным ангидридом и триэтиламином в диметилформамиде после каждой стадии сочетания снижает концентрацию пептидов с делециями не менее чем в десять раз. Если использован 3-нитрофталевый ангидрид, то такие «обрубленные» пептиды несут дополнительно отрицательный заряд и они окрашены. Их легко отделяют хроматографированием на анионобменной смоле.

Завершающее отщепление пептидной связи от твердой основы по функциональной группе бензилового эфира проводят обычно ацидолизом. Если нужен пептид с защи-щенными боковыми цепями, то используют трифторуксусную кислоту. Обычное время реакции при температуре 25С равно 60 минутам. Если при отщеплении должен быть получен незащищенный пептид, то берут жидкий фтористый водород, который в тече-ние 1 часа при 0С снимает все защитные группы на боковых цепях и расщепляет якорную связь в одной операции. Из понятных соображений этот способ не может быть использован на основах из стеклянного материала. В роли нуклеофильных «мусорщи-ков» могут быть использованы добавки анизола или метилэтилсульфида для защиты тирозиновых, триптофановых, гистидиновых и метиониновых остатков от алкилиро-вания карбониевыми ионами (например из ВОС-групп), образующихся в ходе расщеп-ления. Обычно рекомендуется получать продукт пептидного синтеза с защитными функциональными группами, поскольку эти производные гораздо легче получить в кристаллическом виде, чем свободные пептиды.

Пептидный синтез в растворе

Основной недостаток пептидного синтеза в твердой фазе состоит в том, что все при-соединенные к смоле побочные продукты могут быть отделены только на последней стадии синтеза. Другая проблема заключена в том, что локальная концентрация пеп-тида, который может быть получен на полимере, сравнительно низка, а это лимитирует производительность по всем другим исходным продуктам. Вследствие этого получение увеличенных количеств (более 1 г) труднодостижимо. Третья проблема состоит в том, что безопасные в отношении рацемизации способы активации аминокислот, например азидный способ, слишком мягок (длителен) для синтеза в твердой фазе. По этой при-чине обычная методика Меррифилда используется в общем случае для синтеза неболь-ших пептидов, тогда как для получения более сложных полипептидов многие исследо-вательские коллективы предпочитают «классический» способ в растворе и очистку после каждой стадии конденсации (Ф.М.Финн, 1976).

Конденсация пептидных фрагментов

Современные постадийные методы представляют собой прекрасный путь к пептидам вплоть до пентадекапептида. Однородные пептиды, содержащие до ста аминокислот-ных остатков или белки могут получены только из тщательно очищенных меньших защищенных пептидов. Техника сборки пептидных фрагментов использует конденса-цию пептидов с числом аминокислотных остатков около десяти. Отделение непрореа-гировавших небольших исходных пептидов от пептидного продукта с гораздо большей молекулярной массой не представляет сложности и продукты часто отвечают самым строгим требованиям по однородности.

Проблема конденсации олигопептидных блоков чаще всего заключается в низком выходе при сочетании больших фрагментов и в невысокой растворимости больших защищенных пептидов. Последнее осложнение может быть преодолено использова-нием в качестве растворителей диметилсульфоксида (ДМСО) или гексаметилфосфор-триамида (ГМФТА). Правда, эти растворители с высокой полярностью, способствуют рацемизации, и тогда для построения более сложных пептидов с использованием ДЦГК или других аналогичных конденсирующих агентов следует брать в качестве пептидов с концевой карбоксильной группой только такие, у которых С-концевые аминокислоты представлены пролином или глицином. Другие замещенные по аминогруппе пептиды могут быть использованы для сочетания только в медленно протекающем азидном способе, и после каждой конденсации фрагментов надо подтверждать отсутствие рацемизации.

Примером конденсации фрагментов является синтез бычьего инсулина (1970). Триа-контапептидная В-цепь этого гормона была собрана из шести защищенных олигопеп-тидов. Для каждого цикла азидных сочетаний использовалась следующая последова-тельность реакций: а) гидразинолиз С-концевого метилового эфира в течение 2-6 дней, б) образование азида с амилнитритом и HCl в течение 30 минут при -20С, в) нейтра-лизация триэтиламином при -40С и г) сочетание с аминной компонентой сначала нагреванием в течение 12 часов от -40С до 0С и после этого 3 дня при 0С. Тиольная группа цистеинового остатка была защищена образованием дисульфида или полимера с дисульфидными связями.